法規政策

中華人民共和國農業部公告 第2078號

2014-03-31 15:12:07

      根據《獸藥管理條例》和《獸藥注冊辦法》規定,我部組織制定了口蹄疫滅活疫苗內毒素和總蛋白測定法,現予發布,自發布之日起執行。

  特此公告。

  附件:1.口蹄疫滅活疫苗內毒素測定法

        2.口蹄疫滅活疫苗總蛋白測定法

                                     農業部

                                     2014年3月12日

  附件1

口蹄疫滅活疫苗內毒素測定法

  吸取12 ml疫苗放入15 ml離心管中,置50±5℃水浴90分鐘,然后在4℃條件下,以15000 g離心10分鐘,取水相5.0 ml,按現行《中國獸藥典》一部附錄進行檢驗。每頭份疫苗中內毒素含量應不高于50 EU。

  附件2

口蹄疫滅活疫苗總蛋白測定法

  取1瓶疫苗恢復至室溫,在3個1.5ml離心管中分別精確加入100μl疫苗和900μl丙酮,充分混勻,室溫放置10分鐘,在4℃條件下,以15000g離心15分鐘。吸棄液相,沉淀物用400μl丙酮洗滌2次,室溫干燥約15分鐘,加50μl去離子水復溶后,按附注進行檢驗。每毫升疫苗總蛋白含量應不高于500μg。

  附注:口蹄疫滅活疫苗總蛋白測定法

  1.方法與原理

  本法適用于口蹄疫病毒油佐劑滅活疫苗總蛋白含量檢測。本法系福林酚法(lowry法),依據蛋白質分子中含有的肽鍵在堿性溶液中與Cμ2+螯合形成蛋白質-銅復合物,此復合物使酚試劑的磷鉬酸還原,產生藍色化合物,同時在堿性條件下酚試劑易被蛋白質中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸還原呈藍色反應。在一定范圍內其顏色深淺與蛋白質濃度呈正比,以蛋白質對照品溶液作標準曲線,采用比色法測定供試品中蛋白質的含量。

  2.試劑與儀器

  2.1試劑丙酮(分析純)、無菌去離子水、商品化Lowry法改良試劑盒;

  2.2設備酶標儀(全波長),“Μ”型96孔板,卡介苗注射器,單通道和多通道移液器,渦旋震蕩儀,酶標板振蕩器等。

  3.操作步驟

  3.1標準系列稀釋液制備將商品化試劑盒內標準牛血清白蛋白(2mg/ml母液),按下表依次稀釋。

編號

1

2

3

4

5

6

7

8

9

母液(μl)

0

5

25

50

100

150

200

300

400

去離子水(μl)

400

395

375

350

300

250

200

100

0

終濃度(μg/ml)

0

25

125

250

500

750

1000

1500

2000

  3.2檢驗疫苗處理取1瓶疫苗恢復至室溫搖勻后,在3個1.5 ml離心管中分別精確加入100μl疫苗和900μl丙酮,充分混勻,室溫放置10分鐘,在4℃條件下,以15000 g離心15分鐘。吸棄液相,沉淀物用400μl丙酮洗滌2次,室溫干燥約15分鐘,加50μl去離子水復溶備用。

  3.3反應板加樣與讀數

  3.3.1各取3.1稀釋的各濃度牛血清白蛋白標準溶液40μl,以及三重復待檢疫苗樣品40μl,分別加入到96孔板內。用排槍迅速加入200μl改良lowry法試劑盒內試劑,立即用振蕩器混勻30秒;

  3.3.2封膜,室溫孵育10分鐘;

  3.3.3各孔內分別加入20μl 1倍酚試劑(試劑盒內為2倍,用前用去離子水現稀釋),立即用振蕩器混勻30秒;

  3.3.4封膜,室溫孵育30分鐘;

  3.3.5酶標儀測定750nm吸光值,保存讀數。

  3.4數據處理

  根據系列標準蛋白稀釋液的濃度(0μg/ml~2000μg/ml)和750nm吸光值,使用EXCEL以吸光值為X軸,以蛋白標準濃度為Y軸,繪制標準曲線,依據趨勢線求得多項式,其多項式R2≥0.98。

  將被檢樣品的吸光值代入標準蛋白獲得的多項式,計算樣品中蛋白含量,根據取樣量求得1ml樣品中蛋白含量。例如口蹄疫滅活疫苗水相/油相比例為1:1,免疫劑量為2ml時,100μl疫苗經丙酮沉淀后用50μl去離子水復溶,測得濃度即為每頭份疫苗中蛋白濃度,或2ml疫苗中蛋白濃度。結果判定時,將測定值除以2即得每毫升疫苗中總蛋白含量。

  3.5結果判定

  若測定結果為每毫升疫苗總蛋白含量小于或等于500μg,則判定被檢疫苗總蛋白含量符合規定;若測定結果為每毫升疫苗總蛋白含量大于500μg,判定被檢疫苗總蛋白含量不符合規定。

  3.6檢測數據處理舉例

  3.6.1收集數據如表所示

Value

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

0.102

0.149

0.336

0.504

0.836

1.122

1.334

1.702

1.923

--

--

--

B

0.677

1.722

0.252

1.116

2.167

1.020

--

--

--

--

--

--

C

0.640

1.704

0.230

1.050

2.195

0.962

--

--

--

--

--

--

D

0.641

1.716

0.225

1.061

2.175

1.012

--

--

--

--

--

--

E

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

F

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

G

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

H

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

  上述表格中,A1-A9為系列稀釋的標準牛血清白蛋白溶液,A1至A9蛋白濃度依次增高;B、C、D行中1-6列為檢測樣品750nm吸光值,B1-B6為6批不同批次疫苗樣品,每一列為同一疫苗樣品三個重復。

  3.6.2繪制標準曲線:將上表中數據復制到EXCELL表格中,

Value

1

2

3

4

5

6

7

8

9

OD750

0.102

0.149

0.336

0.504

0.836

1.122

1.334

1.702

1.923

蛋白濃度μg/ml

0

25

125

250

500

750

1000

1500

2000

  采用EXCEL程序,選中1-9列對應的兩行數據→“插入”→“散點圖”,選擇“帶平滑線和數據標記的散點圖”,得到以750nm吸光值為X軸,以蛋白濃度為Y軸的曲線圖。選擇“圖表工具”中“布局”→ “趨勢線”→“其他趨勢線選項”,選中“多項式”、“顯示公式”和“顯示R平方值”。通常R平方值大于等于0.98表明標準曲線可信。每一塊96孔板應設一組標準并繪制相應標準曲線。

 

  3.6.3數值計算

  以樣品測定OD750值為X,代入y = 411.69x2+ 220.65x - 3.9423,Y為蛋白濃度,以表中第一批疫苗測定結果為例。該疫苗三重復測定的OD750數據(X)分別為:0.677、0.640、0.641,代入公式計算蛋白含量(Y)分別為:334μg/ml、306μg/ml、307μg/ml,該數據為每毫升水相抗原中總蛋白含量。計算三重復數值的平均值(AVERAGE)為316μg/ml,標準差(STDEV.P)為13.1,變異系數為4.15%(標準差/平均值*100%),將每毫升水相抗原中總蛋白含量,除以2折算為每毫升疫苗總蛋白含量,該疫苗的總蛋白含量為138μg/ml。按照上述方法,可計算其他樣品的總蛋白含量。

  3.6.4結果判定

  同一樣品不同重復間變異系數應小于5.3%,否則試驗不成立,應重做。若測定值小于或等于500μg/ml,則判定被檢疫苗總蛋白含量符合規定;若測定值大于500μg/ml,則判定被檢疫苗總蛋白含量不符合規定。